API 20E 肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统

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2020年06月20日 05:40
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API 20E 肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统-技术支持-上海长源科学技术有限公司
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API 20E 肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统

文章出处:长源科技 发布时间:2005-08-10



API 20
E是肠杆菌科和其它G-杆菌的标准鉴定系统,包括23个标准化微型生化测试和鉴定资料库。可鉴定菌谱名录,请参考鉴定表。

原理


API 20
E试验条是由20个含干燥底物的小管所组成。这些测定管用细菌悬浮液接种。培养一定时间後,通过代谢作用产生颜色的变化,或是加入试剂後变色而观察其结果。
根据说明表判读反应,参照分析图索引和APILAB Plus软件得到鉴定结果。

试剂


一个ref. 20100(25测试)试剂盒包括:
-25条API 20 E试验条;
-25个培养盒;
-25张报告单
-1个封口夹
-1份API 20E操作说明书
一个ref. 20160(100测试)试剂盒包括:
-100条API 20 E试验条
-100个培养盒
-100张报告单
-1个封口来
-1份API 20 E说明书

附加试剂(不包括在试剂盒内)


-NaCl 0.85% 悬浮液, 5 ml (Ref. 20230)或Suspension
Medium县浮液,5 ml (Ref. 20150)
-API 20 E试剂盒 (Ref. 20120)
(TDA,IND,VP 1,VP 2,NIT 1,NIT 2和OX)或单一附加试剂:
TDA (Ref. 70400)
JAMES(Ref. 70540)
VP 1(Ref. 70420)
VP 2 (Ref. 70430)
NIT 1 (Ref. 70440)
NIT 2 (Ref. 70450)
OX (Ref. 70460)
-Zn试剂 (Ref. 70380)
-石腊油 (Ref. 70100)
-API专用一次性加样管 (Ref. 70250)
-API LAB PLUS鉴定结果分析软件
-附加试剂安瓿架 (Ref. 70200)

必要时,需要以下附加试剂


API OF Medium (Ref. 50110)
-测定其发酵型或氧化型代谢作用;
API M Medium (Ref. 51020)
-测定兼性厌氧细菌的运动性。

所需一般实验室设备


-培养箱(35~37℃)
-冰箱
-本生煤气喷灯或酒精灯
-记号笔

培养基和试剂成份


NaCl 0.85%
培养基5ml
or悬浮基物5ml NaCl 8.5g
无离子水1000ml
无离子水
TDA试剂5ml Fecl33.4g
H2O加至 100ml
JAMES试剂5ml J 2183化合物 (保密)0.5g
HCl 1N加至100ml
S24/25:
避免接触皮肤和眼.如与眼接触,必须立即用水冲洗至少10分钟。如与皮肤接触,用肥皂洗和用水冲洗。
IND试剂5ml 对二苯氨基苯甲醛5g
HCL9.25g
H2O15.75ml
异戊醇75ml
危害
R10: 可燃
R20: 吸入伤害
S24/25:避免皮肤和眼接触
VP 1试剂5ml KOH40g
H2O100ml
有毒性
R35: 引起严重伤害.
S2:避免儿童接触.
S26:如接触眼睛,立即冲洗,做医疗处置.
S27:.立即拿走沾染的衣物
S37/39: 戴手套,保护眼/脸
VP 2试剂5ml a-奈酚6g
乙醇100ml
高度易燃
S7: 严密容器存放



附加试剂的使用


在使用前,所有附加试剂需达到室温(20-30℃)
1. API 20 E试剂盒:
-压下安瓿瓶盖直至和安瓿瓶尖接触。
-垂直握住安瓿,用大拇指施加压力於瓶盖斜面以推断安瓿尖。
-将安瓿瓶倒置,并保持垂直。
-小心拧松瓶盖以滴出试剂。
2. TDA, VP 1, VP 2, NIT 1, NIT 2和OX附加试剂(附有滴头的安瓿)
-根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿试剂。
-滴出一滴试剂後小心盖上安瓿。
-根据"试剂的储藏"一栏,储存试剂。
3. JAMES附加试剂(不附有滴头的安瓿)
-根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿JAMES附加试剂溶液。
-使用干燥加样枪将全部溶瓶加入含有冻干成份的滴瓶中。
-将滴头插入滴瓶。
-小心关紧瓶盖。
-摇动滴瓶。
-等待5-10分钟直至所有有效成份溶解。
-使用试剂後,拧紧瓶盖,根据"试剂的储藏"一栏,储存试剂。
4. Zn附加试剂
-打开小瓶
-取大约2-3mg Zn粉未,使用小刮铲将粉未加入反应小管.
-使用试剂後,拧紧瓶盖,根据"试剂的储藏"一栏,储存试剂。

警告及留意事项


只供体外诊断用。
合格检验科工作人员应采用无菌操作方法并防范带传染性物质。
不应用口吸取标本或试剂。
不应使用过期试剂。
由冰箱取出後,所有试剂需达室温(20-30°C)方能使用。
小心开启安瓿瓶:

-用手垂直握住安瓿瓶(白色瓶盖向上)
-尽量将瓶盖压下
-用大拇指顶住瓶盖上斜面部份
-向外施加压力直至瓶盖内瓶尖断裂
*无滴头安瓿:小心移开瓶盖
*附滴头安瓿:垂直倒置安瓿瓶,挤压瓶盖将所有试剂加入滴瓶

所有加样後产品应视之带有污染性,需小心处理。
所有病人标本和细菌培养均可能带有污染性,应跟据国际标准处理(NCCLS M29-72: CDC Manual
Biosafety in Microbiological & Biomedical Laboraties,
1993)
在完成检测、判读後,所有标本,污染物及试条必须高温高压消毒,烧成灰或在丢弃前浸於消毒水内杀菌。
最後鉴定的结果需由合格微生物学家肯定,同时需考虑病史、标本来源、菌落及显微镜下生长形态、其他测试结果,例如药敏结果。



使用说明


所有细菌培养及标本需视为带有传染性,只有合格检验师方能操作无菌技术及遵守有关细菌操作注意事项(NCCLS
M29-72, Protection of Laboratory Worers from Infections
Diseases, Tranmitted by Blood, Body flumids, & Tissue -
2nd Edition; Tentative Guidelines及Biosefety in
Microbiological & Biomedical
Publication No. CCDC) 93-8395, 3rd Edition (May 1993).
或本地规定。)
试验条的准备
准备一个培养盒(盘和盖子),倒入约5ml水於盘的蜂窝小凹中,造成一个湿室。
记菌株资料於盘的边沿部分。
从包装中取出试验条放到盘中。
进行Oxidase氧化酶检测:
-在玻片上放上张滤纸片。
-在滤纸上滴一滴水。
-取一个菌落涂在滤纸上。
-加一滴OX试剂

-如於1至2分钟内呈现深紫色,则为阳性反应。
反应结果应记录於结果报告单上成为第21个测试。
注意:API 20 E鉴定菌谱不包括苛养菌,需采用特别步骤排除需特别营养/培养步骤的菌株。
接种物的制备
-根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿NaCl 0.85% (5ml)或Suspension
Medium (5ml)或使用无杂质无菌5ml盐水/蒸馏水。
-以接种针从分离物的平板上挑取已分纯单个菌落至悬浮基物中。
-仔细研匀以达到均一的细菌悬液
注意:大多数弧菌均嗜盐,如怀疑菌株为弧菌,请使用NaCl 0.85%(5ml) medium 悬浮液。
试验条的接种

用吸管将细菌悬液充满檬酸CIT、VP各GEL管;
其它管仅充满管部(不是杯部);
ADH、LDC、URE、ODC和H2S,则用矿物油覆盖;
盖上盖子,孵育於35~37℃18~24小时。
於周未孵育:API 20
E的生化反应需於孵育18-24小时後判读,如无法进行试条需於温箱取出并置於2-8℃直至可以进行判读。

判读试条
在35~37℃培养18~24小时後,参考说明表判读其结果;
记录由自发代谢作用而产生的结果於报告单上;
如果葡萄糖是阳性并且/或3个或3个以上测定是阳性的话:加试剂观察结果;
-VP测定:各加1滴VP1和VP2试剂,至少等待10分钟,浅粉或红色表明阳性结果,记录於报告单。如浅粉红色在10至12分钟内出现,判断结果为阴性。
-TDA测定:加一滴TDA试剂,深褐色为阳性反应,记录於报告单上。
-IDN测定:加一滴James试剂。反应立即发生:粉红色出现在整个反应应管者为阳性,记录於报告单上。或加一滴吲哚试剂,等2分钟,出现红色环表明为阳性反应。

-NO2测定:各加一滴Nit 1 和Nit
2试剂於葡萄糖管内,待2~3分钟後,红色表示阳性,阴性反应(黄色)可能由於还原至N2(有时还有气泡):加2-3mg锌粉到葡萄糖管,5分钟後,如果管保持黄色表示N2阳性记录於报告
单。如果测定变粉红,这明是阴性;硝酸盐仍留管内,被锌粉还原。
此测试能有效帮助对革兰氏阴性,氧化酶阳性杆菌的鉴定。
注意:Nitrate还原及Indole测试需在最後进行,因为以上反应会产生氧体,影响其他反应判读。在加入有关试剂後,请小心勿调换培养盒。
如果萄萄糖是阴性,并且阳性测定的数目少於2个或等於2个,先不加试剂:
-接种2个API OF培养基证葡萄糖的代谢类型;
-划一个MacConkey平板;
-接种1个API M培养基测定运动性或用显微镜直接观察;
-重新培养24小时;
-如上述那样加入试剂;
-记录试验条和补充试验的结果於告单,参考说明表。
鉴定

-用分析图形检索或APILAB
Plus软件:所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单,每3个测定为一组,每个以1、2和4标明,在每组中,阳性反应以相应的数字相加,由API
20 E的20个测定可得一个7位数。氧化酶反应构其第21个反应,如阳性则为4。
有时,7位数检索编码还不足以区分菌株,需要进行一些补充试验:
-NO3盐还原到亚硝酸盐(NO2);
-亚硝酸盐还原到氮(N2);
-运动性(MOB);
-在MacConkey(McC)培养基上的生长;
-葡萄糖氧化型(OF-O);
-葡萄糖发酵型(OF-F)。
根据相同的原理,将相应的反应编码,则得到一个9个位数的编码。
举例:


5315173-57日勾维肠杆菌
查照分析图形索引和API LAB软件,查照/输入编号後,可得以下信息:
-被鉴定出的种名;
-鉴定百分数,T索引是由模式(典型)图形而得;
-如有与鉴定相反的测定结果,一般可看该种的阳性反应%;
-鉴定质量的评价;

废物处理


使用後,所有的安瓿,试验条和培养盒在处置之前都必须高压灭菌,烧成灰或浸泡於杀菌剂中。

局限性


-API 20E鉴定系统能准确鉴定在鉴定范围(请查阅鉴定表)内的菌种,但不能用於鉴定/排除鉴定范围外的菌种。
-由於API技术和传统技术的不同,有可能出现不同生化反应结果。
-所有沙门氏菌/沙雷氏菌鉴定需血清鉴定确认。

质量控制


培养基、试验条和试剂在生产的不同阶段都已进行严格的系统性质量控制。对愿意进行自我质量控制者,推荐以标准菌株,所得结果如下:
ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARANO2N2
1+-V-V-----+-----------
2++-++----+-++-+++++++-
3---+V+++--V+----V---+-
4+-+-+-V-V-V-++++++++++-
5+-++----+--++-++-+-++-

1. Stenotrophomonas maltophilia (嗜麦芽糖
寡养单胞菌)ATCC51331
bacter cloacae (阴沟肠杆菌)ATCC13047
s mirabilis (奇异变形杆菌)ATCC35659
ella pneumoniae ssp pneumoniae
(肺炎克雷伯菌)ATCC35657
ichia coli (大肠埃希氏菌)ATCC25922
ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.
Profile obtained after 24-48 hours of incubation for
the strain ATCC 51331, using cultures grown on
Trypcase Soy agar + blood
Profile obtain after 18-24 hours of incubation for the
other strains, using cultures grown on Trypcase Soy
agar + blood
Bacterial suspension prepared in NaCl 0.85% Medium


API 20 E 生化反应表


试验底物反应/酶结 果
阴性阳性
ONPG邻硝基苯-半乳糖苷 b-半乳糖苷酶 无色黄(1)
ADH精氨酸 精氨酸双水介酶 黄色 红/橙色(2)
LDC 赖氨酸 赖氨酸脱羧酶 黄色 橙色
ODC 鸟氨酸 鸟氨酶脱羧 黄色 红/橙色(2)
CIT 柠檬酸钠 柠檬酸利用 淡绿/黄 兰绿/兰(3)
H2S 硫代硫酸钠 H2S产生 无色/微灰 黑色沉淀/细线
URE 脲素 脲酶 黄色 红/橙色
TDA 色氨酸 色氨酸脱氨酶 (TDA/立即)
黄色 深褐
IND 色氨酸 吲哚产生 (James试剂/立即或IND吲哚/2分钟)
James
无色
淡绿/黄
IND
黄色 James
粉红

IND
红色环
VP 丙酮酸盐 3-羟基丁酮产生
乙酰甲基甲醇(VP 1 + 2 / 10分钟)
无色 粉红/红色
GEL Kohn明胶 明胶酶 黑色素不扩散 黑色素扩散
GLU 葡萄糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
MAN 甘露醇 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
INO 肌醇 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
SOR 山梨醇 发酵/氧化(4) 兰/兰
绿 黄色
RHA 鼠李糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
SAC 蔗糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
MEL密二糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
AMY 苦杏仁苷 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
ARA 阿拉伯糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色
OX 在滤纸上 细胞色素氧化酶 (OX / 1 - 2分钟)
无色 红色
NO3 - NO2 葡萄糖管 NO2产生还原到N2 (Nit 1+2 / 2-3分钟)
黄色紫色
(Zn / 5分钟)
红色 黄色
MOB API M或显微观察 运动性 不运动 运动
MaC MacConkey培养基 生长 无 有
OF-F
OF-O 葡萄糖
(API OF) 发酵: 石腊油覆盖
氧化: 和空气接触 绿
绿 黄


(1) 淡黄可考虑为阳性。
(2) 培养18-24小时後,橙色应判断为阴性。
(3) 在顶部判读(需氧)。
(4) 发酵始於管的下部,氧化始於管的上部。
(5) 10分钟後如出现淡粉红应判断为阴性。


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