实验室“胡萝卜素植物色素的分离测定”

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2020年06月23日 18:17
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一、纸层析法1.原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素,以石油醚为展开剂进行纸层析,胡萝卜素极性最小,移动速度最快,从而与其他色素分离,剪下含胡萝卜素的区带,洗脱后于450nm波长下定量测定。2.适用范围参照GB12389-90。本方法适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定,其最小检出限为0.11μg。3.仪器和设备(1) 实验室常用设备。(2) 玻璃层析缸。(3) 分光光度计。(4) 旋转蒸发器:具150ml球形瓶。(5) 恒温水浴锅。(6) 皂化回馏装置。(7) 点样器或微量注射器。(8) 滤纸。4.试剂除特殊说明外,实验用试剂为分析纯,水为蒸馏水。4.1 石油醚(沸程30~60℃):同时是展开剂。4.2 无水硫酸钠:分析纯。4.3 5%硫酸钠溶液。4.4 1+1氢氧化钾溶液:取50g氢氧化钾溶于50ml水。4.5 无水乙醇:需脱醛处理。(1) 检验乙醇是否含醛:银氨液:加浓氨水于5%硝酸银液中,直至氧化银沉淀溶解,加入2.5mol/L氢氧化钠溶液数滴,如发生沉淀,再加浓氨水使之溶解。银镜反应:加2ml银氨液于试管内,加入几滴乙醇摇匀,加入少许2.5 mol/L氢氧化钠溶液加热。如乙醇中无醛,则没有银沉淀,否则有银镜反应。(2)脱醛方法:取2g硝酸银溶于少量水中,取4g氢氧化钠溶于温乙醇中,将两者倾入1L乙醇中,摇匀,静置一、两天,将上层清液倾入蒸馏瓶中,蒸馏,弃去初蒸的50ml。(注:蒸馏速度控制在1滴/秒。)4.6 β-胡萝卜素标准贮备液:取5mgβ-胡萝卜素标准品,溶于10ml三氯甲烷中,浓度约为500μg/ml,准确
补充: 柱色谱法
1. 原理和适用范围
同纸层析法,只是将纸层析换成中性氧化铝柱层析。
2.试剂
(1) 中性氧化铝:80~100目。用前180℃烘干4小时至恒重。
(2) 其余试剂同纸层析法。
3.仪器及设备
(1) 色谱柱:为1.0cm×25cm的玻璃柱,底端收缩变细,并有一活塞,用于调控液体流速;距底端上1cm处有一筛板,孔径为16~30μm。用前需干燥。
(2) 其余设备同纸层析法。
4.操作步骤
4.1样品采集和处理同纸层析法。
4.2测定步骤
(1) 样品提取、洗涤等步骤同纸层析法。
(2) 将洗涤后提取液浓缩并定容至10ml。
(3) 柱色谱:将已干燥的中性氧化铝浸泡于石油醚中,以湿法填充色谱柱至高度为15cm,其上端加2cm无水Na2SO4,使石油醚自由流下,保证其水平高于Na2SO4平面0.5cm。(注意色谱柱填充时应避免水分,不要有气泡进入。)将样品提取液加入色谱柱上,自由流下,待提取液流至柱面时,分次加入石油醚2ml,洗涤柱壁,再加入石油醚洗脱,收集流出液至黄色带全部流出。流出液经60℃水浴减压蒸馏后
,N2吹干,定容。
(4) 比色法测定同纸层析法。
5.注意事项
(1) 柱色谱法的优点是在测定胡萝卜素的同时可测定其他类胡萝卜素和色素。类胡萝卜素、色素和胡萝卜素的极性不同,胡萝卜素极性最小先被极性小的石油醚洗脱,增加洗脱液极性(如加入乙醚、丙酮)可先后将极性稍大的类胡萝卜素(如叶黄素、叶红素)、叶绿色洗脱。
(2) 纸层析法和柱色谱法均不能区分α-、β-和γ-胡萝卜素,虽然标准品为β-胡萝卜素,但实际结果为总胡萝卜素。不过天然食品中大部分为β-胡萝卜素,对结果影响不大。两种方法测定结果相当。
(3) HPLC的原理、适用范围、样品前处理及操作同纸层析法,浓缩定容后的样品液不经过纸层析,而进入HPLC的C18柱,经流动相洗脱后,用紫外分光光度计检测。HPLC可分离α-、β-胡萝卜素并可同时测定多种脂溶性维生素,是目前国内外常用的测定方法。但目前本实验室尚没有建立此法

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